NEB致病变异对患者的影响揭示了新型蠕虫肌病疾病机制
科研报道：解析NEB致病变异揭示新型线状肌病机制及Omecamtiv Mecarbil对受力影响
背景与研究动机
线状肌病（Nemaline Myopathy, NEM）是一种罕见的异质性遗传病，主要表现为肌张力减退和肌肉无力。病理上，该病由肌小节Z盘的失序和线状小体的积聚所致，线状小体是Z盘和细丝蛋白的聚集物。据估计，该病的发病率为每10万活产婴儿中约有两例，占先天性肌病的17%。目前，尚无针对该病的有效治疗方法。
线状肌病涉及至少13种基因的致病变异，其中NEB基因的变异是引发该病的一个主要原因，占病理变异的35%。NEB基因编码一种叫做nebulin的巨型细丝蛋白，它在骨骼肌的各种重要生理过程中发挥关键作用，如调节细丝长度（tthin filament length, TFL）、肌节对齐及桥环周期等。因此，本文对NEB基因的致病变异及其对mrNA、蛋白质和力学特性的影响进行了详细研究，旨在揭示新的致病机制，并验证药物Omecamtiv Mecarbil在改善该病患者肌肉功能中的潜力。
研究来源
该研究由Esmat Karimi、Jochen Gohlke、Mila Van Der Borgh等在美国亚利桑那大学、威斯康星医学院、阿姆斯特丹大学医学中心等机构的科研人员共同完成，并发表于2024年《Acta Neuropathologica》。
研究流程
研究对象及样本处理
本研究包含10名确诊的NEM2患者，病理变异类型各异，另设3名未有肌病相关症状的健康个体为对照组。所有肌肉活检样品均从威斯康星医学院的先天性肌病组织库（CMD-TR）获取，经冻存处理至-80°C，随后进行RNASEq分析及蛋白表达鉴定等实验。
RNA测序
冷冻的肌肉组织经过专门的RNA处理后，提取RNA并进行RNA测序。测序后，应用特定软件对RNA数据进行分析，以检查变异对NEB基因转录和RNA剪接的影响。结果显示，多数截断性变异影响了NEB mRNA的稳定性，导致了nmd（无义介导降解，nonsense-mediated decay）。此外，高比例的隐性剪接位点激活也在病人样本中被观察到，这些隐性剪接位点通常在变异影响下才被启用。
蛋白质表达鉴定
采用SDS-琼脂糖凝胶电泳和西方印迹法对nebulin蛋白的表达进行评估，将检测到的nebulin蛋白水平与骨骼肌中的肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MHC）进行标准化对比。结果显示，部分患者的nebulin蛋白水平接近正常，而其他患者则显著降低。另外，通过α-折叠（Alphafold）预测了nebulin的α-螺旋部分结构，发现隐性剪接位点导致的插入可能破坏actin结合位点。
肌肉纤维力学特性
在膜渗透单纤维上进行了力学分析，测量肌肉在不同钙水平下的受力，包括对药物Omecamtiv Mecarbil（OM）处理前后的最大受力和亚极大受力。结果表明，对于病人，OM显著增加了亚极大受力，而这种增加在nebulin水平最低的患者中最为明显。
薄丝长度测量
利用荧光标记的phalloidin对肌肉组织进行染色，测量薄丝长度。部分患者显示薄丝长度缩短，而一名含有扩大nebulin蛋白的患者则显示更长的薄丝长度。
主要发现与结论
基因变异及其对转录和蛋白水平的影响
研究发现，截断性变异普遍导致mRNA的降解，次之是由于nmd过程。这一机制解释了为何在蛋白质水平上检测不到截断的nebulin蛋白。此外，隐性剪接位点的激活导致不合理的RNA剪接及非典型插入，这些对NEB转录和蛋白质水平有不同程度的影响。
蛋白表达水平与肌肉功能的关系
nebulin蛋白水平的降低与薄丝长度（TFL）缩短及肌肉张力下降呈负相关关系。这一现象在蛋白水平最低的患者中最为显著。此外，患者180因NEB扩展变异导致的长处于蛋白结构的nebulin却呈现更长的TFL，这一新发现揭示了线状肌病不仅涉及短细丝，还可能涉及长细丝的病理机制。
药物治疗潜力
OM作为一种小分子激动剂，能够显著提高NEM2患者亚极大受力，特别是对于nebulin水平最低的患者，效果尤为显著。OM通过增加钙敏感性和延长强结合态肌球蛋白头的持续时间，从而在亚极大活化水平显著提高了受力。这一发现为将来OM在治疗NEM患者中的潜在应用奠定了基础。
研究的意义与应用价值
本研究首次揭示了NEB致病变异的新机制，包括隐性剪接位点的激活导致不规则剪接及其对nebulin和薄丝长度的影响。更为重要的是，研究表明OM有望成为改善NEM2患者肌肉功能的有效药物，特别是针对nebulin水平低的患者。这些发现不仅丰富了对线状肌病的分子机理认识，也为开发针对性治疗方法提供了有价值的信息。
研究亮点
- 揭示新致病机制：首次发现隐性剪接位点激活导致的不规则RNA剪接现象及其对蛋白功能的影响。
- OM治疗潜力：发现OM能够显著增强NEM2患者的肌肉受力，尤其对nebulin水平低的患者效果更为显著。
- 蛋白水平与功能的关系：通过详细研究，建立了nebulin蛋白水平、薄丝长度和肌肉受力之间的负相关关系，为后续研究提供了重要依据。
本研究为未来的线状肌病治疗提供了新的思路和潜在解决方案，具备较高的科研和临床应用价值。