circPTP4A2はmiR-20b-5p/YTHDF1/TIMP2軸を介して脳虚血性脳卒中におけるミクログリアの極性化を促進します

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虚血性脳卒中 ミクログリア極性化 circPTP4A2 miR-20b-5p TIMP2

科学論文「circptp4a2はmir-20b-5p/ythdf1/timp2軸を介して脳虚血性脳卒中におけるミクログリアの分極を促進する」の学術報告

背景紹介

脳虚血性脳卒中（ischemic stroke, IS）は、脳血流の閉塞による脳組織壊死であり、世界中で障害と死亡の第二の原因となっています。現在の臨床治療戦略は主に静脈内血栓溶解療法と機械的血栓回収術を含みますが、これらの方法の効果は限られています。したがって、新しい効果的な治療戦略の開発が重要です。ミクログリアは脳内の常在マクロファージとして、急性および慢性の神経炎症反応で重要な役割を果たします。脳虚血性脳卒中の病理段階では、ミクログリアは迅速に活性化し、M1またはM2表現型に分化します。これらの2つの表現型は組織損傷と修復においてそれぞれ異なる機能を果たします。

特に、M1ミクログリアは炎症促進因子を分泌して脳損傷を促進する一方、M2ミクログリアは抗炎症因子を分泌し、神経保護作用を持ちます。したがって、ミクログリアをM2表現型に分極化させることは、脳虚血性脳卒中の潜在的な治療戦略の1つと考えられており、ミクログリアのM2表現型分極のメカニズムを理解することがこの目標を達成するための重要なステップです。

論文の出典

この論文は、ハルビン医科大学第一附属病院救急医学科のXianxin Kang、Yanhui Cao、Guodong Sun、Dongsheng Fei、Kai Kang、Xianglin Meng、Mingyan Zhaoらによって執筆され、2023年9月14日に「Neuromolecular Medicine」誌にオンライン掲載されました。

研究プロセス

研究では、著者らはMCAO/R（中大脳動脈閉塞/再灌流）およびOGD/R（酸素グルコース剥奪/再酸素化）モデルを構築し、脳虚血性脳卒中におけるcircPTP4A2のミクログリア分極調節作用を探究しました。

実験手順

  1. 臨床サンプルの収集

    • 30名の脳虚血性脳卒中患者と30名の健康ボランティアから血液サンプルを収集。
    • 患者が初発かどうかなどの基本的特徴情報を含む。

  2. MCAO/Rモデルの確立

    • 8週齢のC57BL/6マウス（計32匹）を使用し、4グループに分類：sham群、MCAO/R群、MCAO/R+sh-NC群、MCAO/R+sh-circPTP4A2群。
    • マウスでMCAO/Rモデルを構築し、shRNAを用いてcircPTP4A2をノックダウン。

  3. 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色

    • マウス脳組織の梗塞体積を検出。
    • 神経機能スコアにより神経障害を評価。

  4. 免疫蛍光染色

    • 脳組織におけるCD16およびCD206の発現レベルを分析。

  5. 細胞培養と処理

    • ATCCから購入したヒトミクログリア細胞（HMC3細胞）を使用し、OGD/R条件下で in vitro モデルを構築。
    • shRNAノックダウンやmir-20b-5pマイクロRNAの模倣および抑制など、様々なトランスフェクション実験を実施。

  6. 細胞計数キット-8（CCK-8）法

    • 細胞生存率を測定。

  7. フローサイトメトリー

    • 細胞表面のCD16およびCD206の発現を検出。

  8. RNA免疫沈降（RIP）実験

    • 細胞内のcircPTP4A2とmir-20b-5pおよびYTHDF1の相互作用を分析。

  9. RNAプルダウン実験

    • mir-20b-5pとYTHDF1の結合をさらに検証。

  10. デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

    • mir-20b-5pとYTHDF1の結合部位を検証。

  11. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）

    • 標的RNAの発現レベルを検出。

  12. ウェスタンブロット

    • マウスおよび細胞におけるTIMP2やNF-κB経路関連タンパク質など、関連タンパク質の発現を検出。

研究結果

  1. circPTP4A2およびmir-20b-5pの発現

    • circPTP4A2は脳虚血性脳卒中患者の血漿中で有意に上昇し、mir-20b-5pは有意に低下。

  2. circPTP4A2ノックダウンのMCAO/R誘導マウス脳障害への影響

    • TTC染色により、circPTP4A2ノックダウンがMCAO/R誘導マウスの脳梗塞体積を減少させ、神経障害を軽減することが示された。
    • 免疫蛍光染色およびウェスタンブロット分析により、circPTP4A2ノックダウンがミクログリアのM2分極を促進し、M1マーカー（iNOS、CD16）の発現を減少させ、同時にM2マーカー（Arg1、CD206）の発現を増加させることが示された。

  3. circPTP4A2はmir-20b-5pを介してYTHDF1の発現を調節

    • デュアルルシフェラーゼレポーター、RNAプルダウン、RIP実験により、circPTP4A2がmir-20b-5pのスポンジとして機能し、YTHDF1の発現を調節することが検証された。
    • 実験結果は、circPTP4A2またはYTHDF1のノックダウンがTIMP2の発現を低下させ、NF-κB経路の活性化を抑制することを示した。

  4. mir-20b-5pはTIMP2を介してOGD/R誘導ミクログリア分極を調節

    • mir-20b-5pの過剰発現はミクログリアのM2分極を促進し、TIMP2の発現を減少させ、この効果はTIMP2の過剰発現により逆転した。

結論と意義

本研究は、circPTP4A2がmir-20b-5pを抑制することでYTHDF1の発現を調節し、脳虚血性脳卒中の進行過程でミクログリアをM2表現型に分極化させ、神経炎症を減少させ、神経障害を軽減することを初めて発見しました。この発見は脳虚血性脳卒中の新しい治療戦略の理論的基礎を提供し、circPTP4A2、mir-20b-5p、YTHDF1が潜在的な治療標的となり得ることを示しています。

研究のハイライト

  1. 新しく発見された調節軸

    • circPTP4A2/mir-20b-5p/YTHDF1/TIMP2軸の発見は、ミクログリア分極の新しいメカニズムを明らかにしました。

  2. 潜在的な臨床応用

    • この研究は新しい脳虚血性脳卒中治療戦略の開発の基礎を提供し、circPTP4A2が将来の治療標的となる可能性があります。

  3. 豊富な実験デザイン

    • in vivo および in vitro モデルを組み合わせ、異なる実験方法の一貫性を検証し、結論の信頼性を高めました。