新たに確立したスクリーニング法によるPorphyromonas gingivalisのIX型分泌系の機能阻害剤としてのナナオマイシンAおよびその類似体の同定
新型スクリーニング法によるPorphyromonas gingivalis IX型分泌系の機能阻害剤としてのNanaomycin Aおよびその類似物の同定
学術的背景
Porphyromonas gingivalis（ジンジバリス菌）は、グラム陰性嫌気性菌であり、慢性歯周炎の主要な病原体の一つとされています。歯周疾患に加えて、P. gingivalisは糖尿病、関節リウマチ、認知症、早産などの全身疾患とも関連しています。そのため、P. gingivalisの病原性を低下させることは、これらの疾患の治療において重要な戦略の一つです。
P. gingivalisは、IX型分泌系（Type IX Secretion System, T9SS）を介して、gingipainsと呼ばれる高度に加水分解能を持つプロテアーゼを分泌します。これらのプロテアーゼは、環境中のペプチドをエネルギー源として利用します。T9SS関連タンパク質は広く研究されていますが、T9SSに対する特異的な阻害剤はまだ発見されていません。そのため、T9SSの機能メカニズムを研究し、歯周疾患の新しい治療薬を開発するために、T9SS阻害剤をスクリーニングする方法の開発が重要です。
論文の出典
本論文は、Yuko Sasaki、Takehiro Matsuo、Yoshihiro Watanabe、Masato Iwatsuki、Yuki Inahashi、Satoshi Nishida、Mariko Naito、Mikio Shojiによって共同執筆されました。研究チームは、長崎大学、北里大学、帝京大学から構成されています。論文は2024年11月22日にThe Journal of Antibiotics誌にオンライン掲載され、DOIは10.1038/s41429-024-00790-8です。
研究の流れと結果
1. 研究の背景と目的
本研究の目的は、T9SSの機能阻害剤を同定するための新しいスクリーニング法を開発することです。そのために、研究チームは、牛乳カゼインを唯一のタンパク質源とするMC培地（Milk Casein Medium）に焦点を当てました。P. gingivalisがMC培地中で引き起こす濁度の変化を観察することで、T9SSの機能を阻害する化合物を見つけ出すことを目指しました。
2. MC培地の特性分析
研究チームはまず、MC培地の特性を検証しました。P. gingivalisの野生型株ATCC 33277は、MC培地中で濁度の増加を引き起こすが、細菌の増殖は伴わないことがわかりました。さらに、ヨードアセトアミド（Iodoacetamide, IAM）とカルボニルシアニド3-クロロフェニルヒドラゾン（Carbonyl Cyanide 3-Chlorophenylhydrazone, CCCP）が、MC培地の濁度増加を著しく抑制することが示されました。IAMはアルキル化剤であり、gingipainsの活性を阻害します。一方、CCCPはプロトンキャリアであり、T9SSに必要なプロトン動力を破壊します。
さらに、gingipain欠損変異株とT9SS欠損変異株は、いずれもMC培地の濁度増加を引き起こさないことが確認されました。これは、MC培地の濁度変化がgingipainの活性とT9SSの機能に依存していることを示しています。
3. T9SS阻害剤のスクリーニング
MC培地の特性を基に、研究チームはT9SS阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニング法を開発しました。彼らは、603種類の化合物を含む天然化合物ライブラリー（Ōmura Natural Compound Library）を使用し、96ウェルプレートを用いてスクリーニングを行いました。スクリーニングの基準は、化合物がMC培地の濁度増加を抑制するが、BHI培地中の細菌の増殖には影響を与えないことでした。
スクリーニングの結果、OM-173αAとOM-173βAという2つの化合物が、MC培地の濁度増加を著しく抑制することが明らかになりました。これらの化合物は、Nanaomycin Aの類似物であることがわかりました。
4. Nanaomycin Aおよびその類似物の作用機序
研究チームは、Nanaomycin Aおよびその類似物の作用機序をさらに調査しました。これらの化合物は、MC培地中のカゼインタンパク質の分解を抑制することがわかりましたが、gingipainsの活性を直接阻害することはありませんでした。これは、Nanaomycin Aおよびその類似物がT9SSの機能に影響を与えることで、gingipainsの分泌を抑制している可能性を示唆しています。
さらに、研究チームは、Nanaomycin Aおよびその類似物がMC培地中でgingipainsの活性を著しく低下させることを発見しました。特に、Rgp（アルギニン特異的プロテアーゼ）の活性が顕著に低下しました。これは、これらの化合物がT9SSの機能を阻害することで、MC培地中でのgingipainsの蓄積を防いでいることを示しています。
5. 実験的検証とデータ分析
これらの化合物の作用機序を検証するために、研究チームはいくつかの実験を行いました。彼らは、SDS-PAGEを用いてMC培地中のカゼインタンパク質の分解を分析し、Nanaomycin Aおよびその類似物がカゼインタンパク質の分解を著しく抑制することを確認しました。さらに、酵素活性測定実験を通じて、これらの化合物がgingipainsの活性に与える影響を検証しました。
データ分析の結果、Nanaomycin Aおよびその類似物は、MC培地中で用量依存的に抑制作用を示し、そのIC50値は約5 µMであることがわかりました。これらの結果は、これらの化合物がT9SSの機能阻害剤としての潜在的な可能性をさらに支持しています。
結論と意義
本研究の結論は、MC培地がT9SSの機能阻害剤を同定するための有効なスクリーニングツールとして利用できるということです。この方法を用いて、研究チームはNanaomycin Aおよびその類似物をT9SSの潜在的な阻害剤として同定することに成功しました。これらの化合物は、T9SSの機能メカニズムを研究するための新しいツールを提供するだけでなく、歯周疾患の新しい治療薬の候補分子としての可能性も示しています。
研究のハイライト
新しいスクリーニング法の開発：本研究は、MC培地の特性を利用して、T9SS阻害剤をハイスループットでスクリーニングする方法を初めて開発し、T9SSの機能メカニズムを研究するための新しいツールを提供しました。
Nanaomycin Aおよびその類似物の発見：研究チームは、Nanaomycin Aおよびその類似物をT9SSの機能阻害剤として同定し、これらの化合物が臨床応用の可能性を持つことを示しました。
作用機序の解明：一連の実験を通じて、研究チームはNanaomycin Aおよびその類似物がT9SSの機能を阻害することでgingipainsの分泌を防ぐ作用機序を明らかにし、T9SSの機能研究に新たな視点を提供しました。
その他の価値ある情報
本研究では、CCCPがBHI培地中でP. gingivalisの増殖を抑制するが、MC培地中ではより強い抑制作用を示すことも発見しました。これは、CCCPがgingipainsの活性を抑制するだけでなく、T9SSの機能に影響を与えることで細菌の増殖を抑制している可能性を示唆しています。
さらに、研究チームは、異なるP. gingivalis株がMC培地中で引き起こす濁度の変化に違いがあることを発見しました。これは、異なる株におけるgingipainsの発現レベルの違いに関連している可能性があり、P. gingivalisの病原性メカニズムをさらに研究するための新しい手がかりを提供しています。
まとめ
本研究は、新しいスクリーニング法を開発し、Nanaomycin Aおよびその類似物をT9SSの機能阻害剤として同定することに成功しました。これらの発見は、T9SSの機能メカニズムを研究するための新しいツールを提供するだけでなく、歯周疾患の新しい治療薬の候補分子としての可能性も示しています。今後の研究では、これらの化合物の作用機序をさらに探求し、臨床応用の可能性を評価することが期待されます。