神経芽腫の腫瘍微小環境による薬剤耐性

背景

研究背景：内在と外在の腫瘍微小環境（Tumor Microenvironment, TME）因子は治療耐性を引き起こす。本研究は、TMEで産生されるトランスフォーミング成長因子（Transforming Growth Factor, TGF）-β1が神経芽腫（Neuroblastoma, NB）細胞の薬物耐性を増加させることを明らかにした。治療耐性は癌治療失敗の主な原因であり、通常、癌細胞の固有のゲノムおよび染色体の不安定性、選択圧及び腫瘍の異質性に関連したエピジェネティックな変化によって引き起こされる。さらに、治療耐性は外的要因（異常な血流およびTMEの影響など）によっても引き起こされ、環境介在性薬物耐性（Environment-Mediated Drug Resistance, EMDR）と呼ばれる。

神経芽腫は小児に最も多い頭蓋外実体腫瘍であり、高再発リスクを伴う。NB患者の約50％が高リスク癌に分類される。手術、骨髄破壊的化学療法、放射線療法、免疫療法の総合療法が行われているにもかかわらず、50％以上の患者が治療抵抗性または再発性疾患で亡くなる。

研究來源

本研究の著者には、Kévin Louault、Laurence Blavier、Men-Hua Lee、Rebekah J. Kennedy、G. Esteban Fernandez、Bruce R. Pawel、Shahab Asgharzadeh、およびYves A. Declerckが含まれる。彼らはそれぞれ、ロサンゼルス小児病院および南カリフォルニア大学に所属する癌と血液疾患研究センター、The Saban Research Institute、病理学および臨床検査医学ならびに生化学および分子医学部門に所属している。論文は《British Journal of Cancer》誌に発表され、オンライン発表日は2024年5月28日。

研究流程详解

1. 細胞株およびヒト単核細胞の準備：

   • 使用したNB細胞株には、CHLA-255、SK-N-AS、SK-N-SH、CHLA-136、SK-N-BE(2)が含まれ、これらには修正を加えたまたは未修正のMYCNおよびC-MYCが表現されている。NB細胞株はすべてロサンゼルス小児病院から取得および培養された。
   • MSCは健康なドナーの骨髄から取得され、培養された。MNは健康な献血者の末梢血から分離され、実験に使用された。

2. in vitro共培養実験：

   • Transwellを使用して共培養実験を行った。二重共培養のNB:MN比は1:1、NB:MSC比は4:1、三重共培養の比率は4:4:1（NB:MN:MSC）。
   • 異なる細胞成分をそれぞれ培養し、異なる薬剤またはヒトリコンビナントTGFB1の濃度で処理し、実験時間は10分から3日までさまざまである。

3. 薬物感受性テスト：

   • 様々な細胞共培養設定において、NB細胞のドキソルビシン（Dox）およびエトポシド（Etop）に対する感受性をテストし、トリパンブルー排除法を使用して生存細胞を測定した。

4. タンパク質検出と分析：

   • Western Blotを用いてNB細胞溶解物中の複数のタンパク質の発現を分析した。
   • 免疫共沈降（Co-IP）実験を行い、タンパク質複合体を識別した。
   • 核抽出実験を行い、核タンパク質と細胞質タンパク質の分離と発現を評価した。

5. 遺伝子ノックダウン実験：

   • RNA干渉（RNAi）方法を用いて遺伝子ノックダウン実験を行い、遺伝子ノックダウンが標的タンパク質の発現および細胞耐性に与える影響を検出した。

6. 免疫組織化学（Immunohistochemistry）および動物モデル実験：

   • 移植モデルNB腫瘍に対する化学療法薬の感受性を検出し、免疫不全マウスを用いて体内薬物反応実験を行った。
   • 様々なNB腫瘍組織におけるp-NF-κBの発現を免疫組織化学分析で検出した。

研究結果详解

1. TGF-β1誘導のEMDR：
   • 結果は、単独培養されたNB細胞と比較して、TME細胞との共培養72時間後、NB細胞のDoxおよびEtopに対するIC50が顕著に増加したことを示した。Western Blot分析では、TME細胞が多剤耐性