内皮素受体中拮抗剂选择性的结构基础

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拮抗剂 内皮素受体 结构生物学 药物设计 血管稳态

解密内皮素受体的拮抗剂选择性：基于冷冻电镜的研究揭示关键分子机制

学术背景

内皮素（Endothelin, ET）是一种强效的血管收缩肽，在调节心血管功能方面具有重要作用。其家族成员包括ET-1、ET-2和ET-3，这些分子通过与内皮素受体（Endothelin Receptors, ETRs）结合，调控血管张力及整体心血管稳态。内皮素受体主要包括两种亚型，ETA和ETB，它们虽然具有63%的序列同源性，但在配体亲和性和功能上表现出显著差异：ETA偏好结合ET-1和ET-2并诱导强效的血管收缩，而ETB则与三种内皮素亚型均有相似亲和力，主要通过释放一氧化氮诱导血管舒张，并促进ET-1的清除。

由于ETR在多种心血管疾病中发挥重要作用，它们已成为治疗靶点，特别是在治疗肺动脉高压（Pulmonary Arterial Hypertension, PAH）方面。当前，ETA拮抗剂（如Macitentan、Ambrisentan）和ETA/ETB双拮抗剂（如Bosentan）已被批准用于临床应用。然而，尽管对ETB受体结合及激活机制已有广泛研究，对ETA拮抗剂的结构选择性仍了解不足，限制了选择性拮抗剂设计的发展。本研究针对这些未解问题，首次揭示了ETA与关键拮抗剂结合的分子机制，并探索了抗体调控ETA活性的可能性。

研究来源

本文由复旦大学附属中山医院、上海科技大学iHuman研究所和生命科学技术学院等多家机构合作完成，于2024年发表在国际知名学术期刊《Cell Discovery》。研究团队包括Junyi Hou、Shenhui Liu、Xiaodan Zhang等多位研究者，他们分别来自心脏重症监护、生命科学、技术研究领域。

研究设计与流程

1. 冷冻电镜研究的创新策略：
研究者采用冷冻电镜（Cryo-EM）技术解析了ETA与三种拮抗剂（Macitentan、Ambrisentan和Zibotentan）的复合物结构。此外，为了解决静止态G蛋白偶联受体（GPCRs）结构解析的挑战，团队设计了一种优化策略，包括在ETA的胞内环中引入热稳定化的Bril蛋白以增加复合物的稳定性，同时引入专门针对ETA的抗体Fab301，从而显著提高了冷冻电镜数据的质量。

2. 抗体Fab301的作用：
Fab301不仅通过稳定ETA复合物促进结构解析，还表现出对ET-1诱导的ETA信号的拮抗作用。结合Fab301的ETA复合物结构分辨率分别达到3.1至3.2 Å。

3. 实验流程：
研究共设计了以下关键步骤： - 利用冷冻电镜解析三种拮抗剂（Macitentan、Ambrisentan和Zibotentan）与ETA结合的高分辨率结构。 - 比较ETA和ETB受体在激动剂与拮抗剂结合下的不同结构特征。 - 通过分子动力学模拟及位点突变实验，进一步验证关键氨基酸对配体结合及选择性的影响。

主要研究结果

1. ETA与拮抗剂结合的分子机制：
- Macitentan：
作为一种改良的双拮抗剂Bosentan的衍生物，Macitentan具有高ETA选择性。其关键的磺酰胺基团通过与R326、K166、K255等残基形成氢键及离子相互作用，大幅提升了结合稳定性。此外，Macitentan的溴苯基团嵌入受体的疏水核心，与TM5和TM6形成多种疏水相互作用。

  • Ambrisentan：
    作为一种羧酸衍生物，Ambrisentan的分子量较小但对ETA显示出极高的亲和力。其羧基通过离子键结合K166和R326，同时与Q165形成氢键网络，从而牢固地嵌入结合位点。此外，其苯环与TM3、TM4的疏水残基紧密接触，增强了结合的选择性。

  • Zibotentan：
    这种基于磺酰胺的拮抗剂在结合ETA时呈现独特的“椅式”构象。其磺酰胺基团与Q165、K166、R326等形成电性相互作用，而其吡啶环通过极性相互作用显著影响了与ETA的选择性。

2. ETA选择性的关键残基：
ETA的F1613.28和Y1292.53残基在构成紧凑的结合口袋和形成关键相互作用网络方面具有重要作用。而在ETB中，这些位置由体积更小的V1773.28和H1502.53替代，使其结合更大体积的配体（如Bosentan）。

3. 抗体Fab301的作用机制：
Fab301通过与ETA胞外环ECL2的关键残基（如R232、G233）相互作用，实现对ETA的选择性拮抗。Fab301的结合不仅阻止ET-1与ETA的结合，还通过改变ECL2的构象对受体激活产生阻碍。

研究意义

本研究通过冷冻电镜解析，首次揭示了ETA受体拮抗剂选择性结合的分子基础。这些发现为开发选择性强、作用高效的ETA拮抗剂和抗体提供了理论依据，对PAH和其他心血管相关疾病的精准治疗具有重要意义。此外，Fab301作为一种新型抗体，不仅为受体选择性调控提供了模板，还为抗体药物开发开辟了新路径。

研究亮点与展望

  1. 分子机制的深刻洞察：
    本研究揭示了ETA拮抗剂结合口袋中关键残基的作用，并通过结合分子模拟和突变分析验证了这些相互作用的生物学重要性。

  2. 创新的研究策略：
    利用Fab301提高复合物稳定性并助力冷冻电镜解析的创新方法，为未来研究提供了参考。

  3. 临床应用前景：
    研究结果为PAH治疗药物的优化设计提供了强有力的结构基础，同时抗体Fab301的应用也为药物开发提供了新的方向。

科学家们不仅进一步丰富了对GPCR结构与功能关系的理解，也为心血管疾病的精准治疗提供了重要科学支持。