人类胎儿肝终末红细胞生成综合特征及全转录组分析

背景和问题

红细胞生成（Erythropoiesis）是红细胞生产的过程。起初在卵黄囊中发生“原始”红细胞生成，逐渐被胎儿肝脏（Fetal Liver, FL）和出生后骨髓（Bone Marrow, BM）中的“终末”红细胞生成取代。在人类胎儿发展过程中，FL 是关键的红细胞生成器官，但目前对人类 FL 红细胞生成的认识非常有限。本文的研究目的在于综合特征和全球转录组分析人类胎儿肝脏终末红细胞生成，探讨红细胞生成过程中的基因表达模式，并进一步理解培养系统对基因表达的影响。

研究来源

本文由Yongshuai Han, Shihui Wang, Yaomei Wang, Yumin Huang, Chengjie Gao, Xinhua Guo, Lixiang Chen, Huizhi Zhao, 以及Xiuli An等学者共同完成。该研究涉及的机构包括中国郑州大学生命科学学院、纽约血液中心膜生物学实验室、郑州大学人民医院血液科、郑州大学附属肿瘤医院血液科和郑州大学第一附属医院血液科。本文发表于2023年8月30日，刊载于Genomics, Proteomics & Bioinformatics期刊上。

研究详细流程

1. 实验对象与方法：
   • 主要实验对象：人类胎儿肝脏细胞。
   • 红细胞分离与RNA测序：利用表面标记物将原代红细胞在不同发育阶段分离，通过RNA测序（RNA-seq）分析基因表达。
   • 培养系统中红细胞生成：将FL CD34+细胞体外培养，通过RNA-seq比较原代和培养系统中的红细胞转录组。
   • 永生化红细胞系建立：从FL和脐带血（CB）CD34+细胞中永生化红细胞细胞系，并进行表型检测和转录组分析。
2. 人体胎儿肝脏红细胞分离：
   • 采用三相红细胞培养系统，开发了使用糖原A、膜带3和α4整合素作为表面标记物的流式细胞术分离方法，成功分离了各发育阶段的红细胞群体。
3. RNA测序分析与基因表达模式：
   • 对分离的FL红细胞进行全转录组分析，发现基因表达从原红细胞至正红细胞阶段逐渐减少，变化显著。
   • 聚类分析和基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析确定了在蛋白质降解和自噬等过程中表达增加的基因，提示这些途径在红细胞核去除中发挥重要作用。
4. 体外培养系统的特征与其工艺优化：
   • 将FL CD34+细胞培养在三相培养系统中，观察到细胞数量在15天内显著扩增。
   • 通过表达特征分析，发现FL体外培养红细胞生成模式与CB红细胞生成更为接近，同时核去除能力相对较低。
5. 永生化红细胞系的建立与分析：
   • 通过HPV-E6/E7系统永生化FL和CB CD34+细胞，得到FL-iERY和CB-iERY细胞系，表型分析和RNA-seq显示细胞永生化主要发生在前红细胞阶段。
   • 永生化红细胞系虽能进行终末红细胞分化，但核去除能力较差。比较不同红细胞系核去除能力的转录组数据表明，不具核去除能力的红细胞中染色体组织和线粒体自噬相关基因表达水平显著降低。
6. 结果分析与重要发现：
   • 体外培养的红细胞与原代红细胞相比，脂质代谢相关基因表达上调，表明培养系统对红细胞的能量需求较高。
   • 永生化红细胞系在终末红细胞生成研究中具有重要研究价值，差异化表达的血红蛋白及其调控因子的分析显示，永生化红细胞系在α-型血红蛋白转换研究中的潜在应用。

结果和结论

本研究通过综合转录组分析揭示了人类胎儿肝脏红细胞生成的新机制。相比体外培养，原代红细胞在红细胞生成过程中的基因表达表现出更多的差异。通过红细胞分离和双细胞流式细胞排序技术，本研究能够区分红细胞生成不同发育阶段的基因表达，从而揭示了终末红细胞生成的关键生物途径。

建立的永生化红细胞细胞系在研究终末红细胞生成中有重要应用潜力，特别是在血红蛋白转换等方面。通过比较不同来源红细胞在红细胞核去除中的基因表达，发现染色体组织和线粒体自噬相关基因表达调控的缺陷是导致红细胞无法核去除的主要机制。

研究价值和亮点

本研究的亮点包括提出了人类胎儿肝脏红细胞生成过程中的关键基因表达模式，证明了培养系统对红细胞生成的影响，并首次建立了胎儿肝脏来源的永生化红细胞细胞系，为进一步研究终末红细胞生成过程提供了重要工具。通过揭示永生化红细胞核去除能力差的机制，本研究提出了可能改善方法的方向。这些发现为理解红细胞生成过程中的分子机制提供了重要洞见，同时为未来的细胞和基因治疗研究奠定了基础。

结语

本研究综合了人类胎儿肝脏和培养系统中红细胞生成的不同特性，通过建立永生化红细胞细胞系，为进一步研究胎儿肝脏红细胞生成提供了宝贵的资源。RNA-seq数据和建立的细胞系将为未来的红细胞生成研究和治疗手段开发提供重要依据。