PRRPとPRRPRの分子認識およびシグナル伝達メカニズムの解析

研究背景

神経ペプチドは神経系において最も豊富なシグナル分子であり、100種類以上が同定されており、代謝、痛覚、繁殖などの生理過程で重要な役割を果たしています。その中でもRF-アミドペプチドは、C末端にアルギニン-フェニルアラニン-NH₂（RF-アミド）モチーフを持つことで特徴付けられ、プロラクチン放出ペプチド（PRRP）、ニューロペプチドFF（NPFF）、キスペプチン（Kisspeptin）などが含まれます。RF-アミド神経ペプチドは特定のGタンパク質共役受容体（GPCR）と結合することで広範な生理機能を調節します。しかし、PRRPおよびその受容体PRRPRはストレス、食欲、痛み、心血管機能の調節に重要な役割を果たしているにもかかわらず、その受容体結合および活性化の分子機構は完全には解明されていません。

PRRPは高度に保存されたRF-アミド神経ペプチドで、逆薬理学研究を通じてPRRPRの内因性リガンドとして同定されています。PRRPは主にGq/11シグナル経路を介してPRRPRとシグナルを伝達し、またGi/o経路を活性化する可能性もあります。しかし、PRRPとPRRPRの構造および相互作用に関する既存の研究は限られており、その機能メカニズムの深い理解を制約しています。このため、本研究では冷凍電子顕微鏡（Cryo-EM）を用いて、PRRPがPRRPRに結合しGqおよびGi異三量体を活性化する構造を明らかにし、選択的な薬剤開発のための構造基盤を提供しました。

研究の出典

本論文は《Cell Discovery》に掲載され、中国科学院上海薬物研究所、中国科学院大学、南京中医薬大学、および上海交通大学などの複数の機関の研究者によって共同で行われました。主要著者にはYang Li、Qingning Yuanが含まれ、対応する著者はH. Eric XuおよびLi-Hua Zhaoです。本研究は、PRRPとPRRPRの相互作用の重要な構造的特徴を明らかにし、神経ペプチド-受容体システムのメカニズム研究および薬剤開発の基盤を築きました。

研究方法

1. 研究の流れ

研究者はまず、PRRPRの全長野生型受容体を構築し、タグや小分子プローブを導入してGPCR-Gタンパク質複合体の安定性を高めました。その後、Cryo-EM技術を用いて、20アミノ酸からなるPRRP活性アイソフォーム（PRRP20）がPRRPRに結合し、GqおよびGiを活性化した際の複合体構造を解析しました（分解能はそれぞれ2.96 Åと2.97 Å）。さらに、分子動力学（MD）シミュレーションおよび機能実験を通じて、異なる複合体の結合エネルギー、柔軟性、および活性化の特徴を分析しました。

2. 主要な実験技術

• 複合体の調製：昆虫細胞発現システムを使用してPRRPRおよびそのリガンドを共同発現し、親和性精製およびゲルろ過法により高純度の複合体サンプルを取得しました。
• 冷凍電子顕微鏡解析：液体窒素環境下でサンプルを凍結し、Titan Krios G4電子顕微鏡を用いてCryo-EMデータを収集し、深層学習による強化および分子モデリングによって分子構造を再構築しました。
• 分子動力学シミュレーション：PRRPR-Gq/Gi複合体モデルを構築し、200 nsのシミュレーションを行い、リガンド結合および受容体活性化の動的挙動を調査しました。
• 機能検証：BRET2アッセイを用いてPRRP20によるGqおよびGiの解離効率を分析し、さらに変異実験によりシグナル伝達に関与する重要なアミノ酸の役割を確認しました。

研究結果

1. PRRP20とPRRPRの結合における重要な構造

PRRP20はL字型の構造を取り、そのC末端のRF-アミドモチーフがPRRPRのリガンド結合ポケットに挿入されます。構造解析により、PRRP20のC末端がPRRPRと複数の極性および疎水相互作用ネットワークを形成しており、C113².⁵⁷、T117².⁶¹、Q141³.³²、H321⁷.³⁹などの重要なアミノ酸が同定されました。これらの相互作用はPRRP20の高い親和性に不可欠です。さらに、R19およびF20の保存性は、異なるRF-アミドリガンド受容体において一般的に重要であることを示しています。

2. PRRPRの活性化機構

PRRPRの活性化は、膜貫通領域TM6の外向きの移動およびTM7の内向きの移動を伴い、これらの構造変化はシグナルを細胞内領域に伝達し、Gタンパク質と結合します。F20はQ141³.³²との極性相互作用を通じてTM3の構造変化を引き起こし、PRRPRを活性化します。本研究はまた、他のGPCR受容体とは異なるPRRPR特有の活性化経路を明らかにしました。Y146³.³⁷はTM5との相互作用を介してTM6の移動を促進し、この機構は他のGPCRとは異なります。

3. PRRPRとGq/Giの選択的結合

PRRPRとGqおよびGiの結合は構造的に顕著な違いを示しており、特にTM6およびGαサブユニットのα5ヘリックスの相対位置において差異が見られます。GqはPRRPRとの結合に対してより強い傾向を示し、これはα5ヘリックスの「波状フック」領域における独特の極性ネットワークに関連している可能性があります。変異実験により、これらの相互作用がシグナル選択性において重要であることが確認されました。

研究の意義

本研究は、高解像度Cryo-EM構造を通じてPRRPとPRRPRの結合およびシグナル伝達の分子機構を明らかにし、神経ペプチド-受容体システムの選択的な薬剤開発に向けた構造基盤を提供しました。これらの発見は、RF-アミド神経ペプチドの認識機構の理解を深めるだけでなく、食欲、ストレス、および痛みなどに関連する疾患の治療戦略の設計にも新たな手がかりを提供します。また、本研究で使用された革新的な方法論は、他のGPCR研究にとっても重要な参考資料となります。

研究のハイライト

1. PRRP20とPRRPRの結合における分子の詳細を明らかにし、RF-アミドモチーフ認識の一般的なメカニズムを提供。
2. PRRPRの特有な活性化経路と他のGPCRとの違いを解明。
3. PRRPRとGq/Giの選択的結合に関する構造基盤を提供し、選択的薬剤の開発に寄与。

本研究は、PRRPRの構造研究における空白を埋めるだけでなく、将来のGPCRメカニズム研究および薬剤設計に対して貴重な資源。