单细胞与空间转录组联合分析揭示胃癌中Hedgehog通路的细胞异质性

学术背景

胃癌（Gastric Cancer, GC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均居高不下。尽管在化疗、放疗和靶向治疗等方面取得了一定进展，但胃癌的治疗仍然面临巨大挑战。胃癌的侵袭性和异质性使其成为难治性癌症之一，尤其是晚期患者的生存率极低。肿瘤细胞的侵袭和转移是导致复发和死亡的主要原因，而现有的治疗手段无法完全解决这些问题。免疫治疗作为一种有前景的治疗模式，也面临着肿瘤微环境和免疫复杂性的挑战。因此，深入理解胃癌的发病机制，尤其是从基因、分子到表型水平的全面探索，对于更好地管理疾病和减轻患者负担至关重要。

Hedgehog（Hh）通路在胚胎发育和成人组织中均发挥重要作用，参与细胞增殖、分化和组织形态发生。在癌症中，Hh通路的异常激活与多种肿瘤的发生和发展密切相关。特别是在胃癌中，Hh通路的异常激活与肿瘤增殖、侵袭和转移密切相关。此外，Hh通路还通过调控癌症干细胞特性影响肿瘤的治疗和预后。尽管针对Hh通路的治疗策略已成为癌症治疗的焦点之一，但作为胃癌治疗靶点的Hh通路仍需进一步研究和验证。

单细胞测序技术在癌症研究中发挥了重要作用，能够揭示肿瘤的多样性、进化模式、治疗耐药性和治疗反应性。然而，单细胞测序技术无法保留空间背景信息。空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）作为一种新兴技术，弥补了这一不足，能够揭示组织或肿瘤中细胞的空间分布和相互作用。通过结合RNA测序数据和空间信息，ST技术为研究组织中的细胞类型、位置和相互作用提供了详细见解。本研究结合单细胞测序和空间转录组数据，深入探索了Hh通路在胃癌中的潜在分子机制，旨在为胃癌的肿瘤异质性提供更深入的理解，并识别新的治疗策略。

论文来源

本论文由Guoliang Zhang、Guojun Xia、Chunxu Zhang、Shaodong Li、Huangen Wang和Difeng Zheng共同撰写，作者均来自中国浙江省绍兴市中心医院普通外科。论文于2024年9月9日在线发表在《Genes & Immunity》期刊上，DOI为https://doi.org/10.1038/s41435-024-00297-0。

研究流程与结果

数据获取

本研究使用了三种类型的胃癌数据：批量转录组数据、单细胞测序数据和空间转录组数据。批量转录组数据集及相关临床信息来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库，涵盖了407名胃癌患者的数据。单细胞测序数据集来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO），具体包括GSE163558和GSE184198条目，包含3个胃癌样本和2个配对的正常样本。空间转录组数据来自CROST数据库（ID: visdp000078），该数据库整合了来自8个物种的1033个空间转录组样本，使用了5种技术平台：10x Visium、Slide-seqV2、MERFISH、10x Xenium和NanoString COO。

单细胞测序分析

在单细胞测序数据分析中，所有样本均使用10x单细胞测序方法进行测序。随后，使用“Seurat” R包生成Seurat对象，整合所有样本并进行数据过滤和校正。质量控制措施排除了基因计数低于200或高于6000的细胞，以及线粒体基因百分比（pctMT）超过15%的细胞。通过SeuratNormalizeData函数对每个细胞的表达谱进行归一化处理，并使用logNormalize方法进行归一化。随后，对前2000个基因进行主成分分析（PCA），并选择前15个显著主成分进行后续分析，使用UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）可视化细胞分布。通过手动注释和参考先前研究的标记基因，将细胞分为10个细胞群，包括T细胞、B细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞、上皮细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞。

Hedgehog通路相关基因集评分

为了评估Hh通路相关基因在胃癌肿瘤微环境中的表达，本研究使用了五种评分方法：AUCell、UCells、singscore、GSVA和AddModuleScore。通过整合这五种方法的评分结果，进行归一化和标准化处理，最终生成综合评分用于后续分析。结果显示，Hh通路相关基因在上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中高度表达，尤其是在肿瘤相关成纤维细胞中表达显著高于正常样本。

成纤维细胞发育轨迹分析

基于Hh评分，本研究选择了成纤维细胞群进行进一步分析。通过Monocle软件包构建成纤维细胞的发育轨迹，发现Cluster 24成纤维细胞处于发育的早期和中期阶段，而Cluster 21成纤维细胞处于发育的晚期阶段。由于Cluster 21成纤维细胞来自肿瘤样本，这一发现表明正常成纤维细胞可能转化为肿瘤相关成纤维细胞。进一步分析发现，Wnt2、Gli3、CCND1和Hip1基因在成纤维细胞发育过程中表达逐渐增加，提示这些基因在正常成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化中可能发挥重要作用。

细胞相互作用分析

为了深入探讨Hh在胃癌成纤维细胞中的作用，本研究将成纤维细胞分为Hh高表达成纤维细胞（Hh_high_fib）和Hh低表达成纤维细胞（Hh_low_fib），并使用CellChat软件包进行细胞间通讯分析。结果显示，Hh_high_fib与其他细胞群直接相互作用，尤其是作为信号发射者与上皮细胞和内皮细胞相互作用。这些发现表明，Hh相关上皮细胞在胃癌肿瘤中发挥关键作用。

空间转录组分析

在空间转录组数据分析中，本研究使用10x空间转录组方法对数据进行处理，并通过Seurat R软件包进行归一化和批次效应去除。通过降维聚类和去卷积分析，识别了9种不同的细胞类型，包括内皮细胞、上皮细胞、Hh_high_fib、Hh_low_fib、巨噬细胞、肥大细胞、浆细胞、平滑肌细胞和T细胞。相关性分析显示，Hh高表达成纤维细胞与平滑肌细胞显著正相关，而与Hh低表达成纤维细胞显著负相关，表明Hh表达在成纤维细胞的发育和分化中起重要作用。

CCND1成纤维细胞在胃癌中的作用

基于CCND1在成纤维细胞发育中的重要作用，本研究将成纤维细胞分为CCND1阳性成纤维细胞（CCND1+ fib）和CCND1阴性成纤维细胞（CCND1- fib）。通过空间转录组数据分析，发现CCND1阳性成纤维细胞主要在Cluster 1、5和6中高度浸润。进一步分析发现，Cluster 1细胞处于发育的早期阶段，而Cluster 5和6细胞处于发育的晚期阶段，且CCND1表达在发育的中晚期逐渐增加，提示其在肿瘤发育的中晚期可能发挥重要作用。

批量转录组生存分析

通过整合批量转录组数据，本研究评估了CCND1+成纤维细胞浸润对胃癌患者预后的影响。结果显示，CCND1水平在胃癌肿瘤组织中显著高于正常组织，且CCND1+成纤维细胞高浸润的患者预后较差。此外，CCND1+成纤维细胞与肿瘤免疫逃逸能力呈正相关，提示其可能影响免疫治疗的效果。

结论

本研究通过结合单细胞测序和空间转录组数据，深入探讨了Hh通路在胃癌中的作用。基于批量转录组数据，验证了CCND1+成纤维细胞高浸润是胃癌患者的风险因素，并可能影响免疫和化疗的治疗效果。研究为胃癌和Hh通路的研究提供了独特的见解，并为癌症治疗策略提供了新的方向。

研究亮点

1. 重要发现：Hh通路在胃癌成纤维细胞中高度表达，CCND1+成纤维细胞高浸润是胃癌患者的风险因素。
2. 方法创新：结合单细胞测序和空间转录组数据，全面揭示了胃癌肿瘤微环境中的细胞异质性和相互作用。
3. 应用价值：研究结果为胃癌的治疗策略提供了新的方向，尤其是针对Hh通路和CCND1的靶向治疗。

未来研究方向

未来的研究可以扩展到多中心数据和多样化的患者群体，以增强结果的普适性和稳健性。此外，结合其他组学技术，进一步探索胃癌进展和治疗耐药性的分子机制，将有助于开发更有效的个性化治疗策略。