使用临床引导的培养方法从造血干/祖细胞生成异基因CAR-NKT细胞

2024-07-10 Wed
探讨临床应用的CAR-NKT细胞生成研究背景嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已获得食品和药物管理局（FDA）的批准，用于治疗B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤。然而，使用自体CAR-T细胞产品存在高成本、制造时间长、患者获取难度大的问题。尤其是对于疾病进展或接受过前期治疗的患者，可能没有足够的或功能正常的T细胞来生产CAR-T细胞。为了开发“现成的”细胞治疗产品，两种方法正在探索：一种是使用常规的αβT细胞，通过删除内源性TCR表达来减少移植物抗宿主病（GVHD）风险，另一种是使用天生具有低GVHD风险的细胞类型，如巨噬细胞、NK细胞和不变自然杀伤T（iNKT或NKT）细胞。
NKT细胞是一种特殊类型的αβT细胞，其特征在于不变的TCRα链和NK标记物共同表达。由于其识别非多态性CD1d分子，这些细胞不像常规T细胞那样引发GVHD。NKT细胞显示出对发展“现成”细胞疗法的潜力，具有强大的肿瘤杀伤活性，能够渗透肿瘤并连接先天和适应性免疫反应。然而，NKT细胞疗法的发展受到人血NKT细胞稀少和难以从外周血单核细胞（PBMCs）中扩展的限制。因此，识别适应临床的从其他来源生成异体NKT细胞的方法是有意义的。
研究来源该研究由Yan-Ruide Li、Yang Zhou、Jiaji Yu等多位研究者共同撰写，隶属于多家机构，包括University of California, Los Angeles等。研究于2023年8月23日提交，2024年3月28日接受，并将在线发表在《Nature Biotechnology》期刊上。
研究流程流程详解研究设计：
从商业供应商获得冷冻的人类脐带血来源的CD34+造血干/祖细胞（HSPCs），并用于生成NKT细胞。
第0阶段：对CD34+ HSPCs进行解冻，并利用病毒载体转导插入CAR和其他感兴趣的基因。
整个培养在无饲料和无血清的环境中进行，以符合临床要求。
细胞生成过程：
第1阶段：HSPCs扩展（2周）。
第2阶段：NKT细胞分化（1周）。
第3阶段：NKT细胞进一步分化（1周）。
第4阶段：NKT细胞扩展（2周）。
实验细节及样本处理：
在NKT细胞扩展阶段测试了两种替代策略，使用人类饲养细胞：α-半乳糖基神经酰胺（αGC）加载的健康供体PBMCs或基于K562的人工抗原呈递细胞（AAPCs），以评估临床开发的可行性。
分化后的NKT细胞进行了流式细胞术分析，以确定细胞表型和功能。
主要实验：
在多发性骨髓瘤（MM）模型中测试生成的异体CAR-NKT（alloCAR-NKT）细胞的抗肿瘤功效、扩展性和持久性。
在脾脏、骨髓和外周血中进行了流式细胞术和单细胞TCR测序，以验证NKT TCR的均一性表达和其他肿瘤抗原的组合。
数据分析：
使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行基因分析，评估不同阶段、不同治疗细胞的基因表达谱。
整合基因表达、表型分析和功能测试的数据，以揭示alloCAR-NKT细胞在抗肿瘤环境中的性能和机制。
实验结果细胞生成和扩展：
生成的alloCAR-NKT细胞在产量和纯度方面显示出高一致性，从输入的CD34+ HSPCs到输出的成熟alloCAR-NKT细胞实现超过100万倍的扩展。
表型和功能：
alloCAR-NKT细胞在流式细胞术中表达典型的NKT细胞表型。
在体外实验中，allo/15bCAR-NKT（含IL-15增强）细胞显示出强大的免疫功能，包括高水平的效应细胞因子和细胞毒分子。
ELISA和免疫荧光分析显示这些细胞的抗肿瘤效应, 包括通过多靶点机制（CAR、TCR和NK受体）进行肿瘤细胞杀伤。
抗肿瘤功效：
在多个原发性多发性骨髓瘤样本中，allo/15bCAR-NKT细胞表现出明显的肿瘤细胞杀伤能力。
在人类MM异种移植物小鼠模型中，一次性给药的allo/15bCAR-NKT细胞实现了肿瘤消除和长期的动物生存。
肿瘤环境和免疫逃逸：
allo/15bCAR-NKT细胞显示出对肿瘤微环境（TME）内免疫抑制细胞的选择性清除效果。
在有效肿瘤杀伤的同时，不引起显著的GVHD或细胞因子释放综合症（CRS）。
研究结论生成的alloCAR-NKT细胞在流程、性能和安全性方面均表现出卓越的特点，包括：
- 高纯度和一致性的细胞生成。
- 针对多靶点的抗肿瘤能力以及优越的细胞生存和效应功能。
- 在一定条件下，不引起GVHD和CRS，显示出良好的临床应用潜力。
研究意义该研究表明，通过优化临床指导的细胞培养方法，可以成功生产高效的异体CAR-NKT细胞，在不依赖三维培养和异种饲养条件下，实现了广泛的应用潜力。这一成果为多种血液癌症和实体肿瘤的细胞治疗提供了新的机会，并且可能扩展到其他疾病的治疗。