加齢依存的なHapln1の喪失がメラノーマにおける内皮ICAM1の間接的な上方調節を介して血管の完全性を侵食する

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年齢関連のHAPLN1喪失はメラノーマ内皮細胞のICAM1を間接的に上方調整することで血管の完全性を損なう

2024年3月に『Nature Aging』に掲載された「Age-dependent loss of HAPLN1 erodes vascular integrity via indirect upregulation of endothelial ICAM1 in melanoma」と題する研究論文が重要な研究成果を明らかにしました。この研究はJohns Hopkins Bloomberg School of Public Health生化学・分子生物学科のGloria E. Marino-BravanteとAshani T. Weeraratnaを筆頭とするチームによって行われ、年齢関連のメラノーマ環境におけるHAPLN1（Hyaluronan and Proteoglycan Link Protein 1）の喪失がどのように血管の完全性に影響を与え、その潜在的な治療戦略を探ることを目的としています。

研究背景

メラノーマはアメリカで5番目に多く診断される癌であり、最も致命的な皮膚癌です。統計によれば、アメリカだけでも毎年約7990人がメラノーマで死亡しています。年齢が上がるにつれてメラノーマの予後は顕著に悪化し、55歳以上の患者では疾患再発の期間が大幅に短くなり、5年生存率に影響します。内在する年齢が癌の進行に与える影響は以前から認識されていたものの、その複雑なメカニズムの理解は深まりつつあります。研究によれば、腫瘍微小環境（Tumor Microenvironment, TME）に存在する多くの成分、例えば血管は癌の進行に重要な役割を果たします。したがって、老化とメラノーマの進行の関係を理解することは新たな治療法の開発に重要です。

研究目的

先行研究では、メラノーマに関連する血管におけるHAPLN1の減少が癌の進行を遅らせることが示されています。HAPLN1は皮膚真皮における重要な細胞外マトリックスタンパク質であり、その減少はメラノーマ血管の完全性が損なわれ、血管透過性が増加することが証明されています。本研究の主な目的は、老年患者のメラノーマ微小環境においてHAPLN1が血管内皮細胞ICAM1（Intercellular Adhesion Molecule 1）に与える間接的な影響と、ICAM1がメラノーマの進行に与える影響を探ることです。

研究方法

本研究では、一連の実験技術を用いてHAPLN1喪失がメラノーマ微小環境において果たす役割とそのメカニズムを詳細に調査しました。これらの技術には免疫組織化学（IHC）、二次高調波発生イメージング（SHG）、電気インピーダンス測定（Impedance-Based Assays）、および免疫完全な同系マウス研究が含まれます。

ワークフロー

研究は複数の手順を含みます：

  1. マウスモデルの確立と処理：

    • 若齢（6-8週）および老齢（>52週）のマウスにYoung Syngeneic Melanoma (YUMM1.7)細胞を用いてメラノーマモデルを確立。
    • 老齢のマウスに再組換えヒトHAPLN1（rHAPLN1）またはPBSを皮下注射し、腫瘍内の血管新生に対する影響を観察。

  2. インビトロ細胞培養とマトリクス処理：

    • ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）を用いた3D血管新生スフェロイド実験を実施。線維芽細胞が再形成したコラーゲンマトリクスに埋め込み、HAPLN1が高低異なる環境下で血管新生能力を比較。

  3. タンパク質発現および血管壁の完全性検出：

    • 異なるマトリクス上で培養したHUVECsのVE-cadherin（血管内皮カドヘリン）の発現状況を検出し、血管壁の完全性を評価。インビトロ模擬検査で電気インピーダンス、FITCデキストラン漏えい検査などを通じて内皮細胞のバリア機能を評価。

  4. ICAM1の発現と阻害実験：

    • ICAM1の発現を測定し、血管透過性の調節における役割を評価。インビボでICAM1阻害抗体を注射し、メラノーマの成長と転移への影響を観察。

サンプルと技術

これらの過程で、サンプル数は各グループ3-12個で、多様な実験技術を使用しました。免疫組織化学、免疫蛍光、リアルタイム定量PCR (qRT-PCR)、タンパク質プロテオミクス分析、shRNAを用いたHAPLN1のノックダウンなど多種の遺伝子抑制戦略が含まれました。

データ解析

データ解析には、画像内のタンパク質発現の相対強度や統計処理が含まれ、GraphPad Prism v9ソフトウェアを用いた統計検定（t検定、ANOVA、非パラメトリックMann-Whitney検定など）を使用しました。

研究結果

  1. HAPLN1が血管新生およびマトリクスに与える影響：

    • HAPLN1低レベル環境（老年または若年マウスでのHAPLN1ノックダウン）ではHUVECsの血管新生能力が顕著に増加するが、HAPLN1高レベル環境（若年または老年+HAPLN1再組換え処置）では顕著に減少。
    • 免疫組織化学のデータでは、老年マウスの腫瘍中のフィブロネクチン（Fibronectin）レベルは若年マウスよりも顕著に高く、HAPLN1再組換え処置がフィブロネクチンレベルを顕著に低下させることが示されました。

  2. VE-cadherin発現およびマトリクス硬さ：

    • HAPLN1高レベルのマトリクス上で培養された内皮細胞はより高いVE-cadherinレベルを示し、HAPLN1低レベルのマトリクスの細胞は低いVE-cadherinレベルを示し、HAPLN1が血管壁の完全性において重要な役割を果たしていることを示唆。
    • 電気インピーダンス測定では、HAPLN1高レベルマトリクス上で形成された内皮細胞モノレイヤーの電気抵抗値が高くなり、バリア機能が改善されたことを示しました。

  3. ICAM1の役割：

    • qRT-PCRおよびウェスタンブロット分析では、HAPLN1低レベルマトリクス上でICAM1の発現が顕著に増加し、ICAM1の上方調整がVE-cadherinの発現を低下させ、血管透過性に影響を与えることを示唆。
    • インビボでICAM1抗体を注射された老年マウスの腫瘍サイズが顕著に縮小し、転移も顕著に減少し、ICAM1がメラノーマ進行における重要な役割を果たしていることが確認されました。

研究の意義

研究結果から、HAPLN1の喪失が基質剛性を増加させることにより、ICAM1を間接的に上方調整し、血管透過性を増加させることでメラノーマの転移を促進することが示されました。この結果は、年齢関連の腫瘍微小環境の変化を理解するための新たな視点を提供し、ICAM1を標的とすることでメラノーマの進行を抑制できる可能性があることを示しました。

研究のハイライト

  • HAPLN1が基質依存的な間接メカニズムを通じてICAM1を上方調整し、血管の完全性に影響を与えることを発見。
  • ICAM1を標的とする治療戦略が老年メラノーマ患者の予後を改善する可能性があることを示唆。
  • インビボおよびインビトロの多重実験を通じて、HAPLN1がメラノーマ微小環境における内皮細胞機能を調整することを実証。

これらの発見は、年齢関連の腫瘍生物学の理解を広げるだけでなく、新たな標的治療の開発に重要な手がかりを提供します。今後、異なる腫瘍タイプや臨床環境における適用性と有効性をさらに探求する必要があります。