単細胞および空間トランスクリプトーム解析を組み合わせた胃癌におけるHedgehog経路の細胞異質性の解明

学術的背景

胃癌（Gastric Cancer, GC）は世界的に見ても最も一般的で致命的な悪性腫瘍の一つであり、発症率と死亡率の両方が高い。化学療法、放射線療法、標的治療などの進展にもかかわらず、胃癌の治療は依然として大きな課題を抱えている。胃癌の浸潤性と異質性は、特に進行期患者の生存率が極めて低いことを特徴としている。腫瘍細胞の浸潤と転移は再発と死亡の主な原因であり、既存の治療法ではこれらを完全に解決することはできない。免疫療法は有望な治療モデルとして注目されているが、腫瘍微小環境と免疫の複雑性に直面している。したがって、胃癌の発症メカニズムを遺伝子、分子、表現型レベルで深く理解することは、疾患の管理と患者の負担軽減に不可欠である。

Hedgehog（Hh）経路は、胚発生および成人組織において重要な役割を果たし、細胞増殖、分化、組織形態形成に関与している。がんにおいて、Hh経路の異常な活性化は多くの腫瘍の発症と進行と密接に関連している。特に胃癌では、Hh経路の異常な活性化が腫瘍の増殖、浸潤、転移と関連している。さらに、Hh経路はがん幹細胞の特性を調節することで、腫瘍の治療と予後に影響を与える。Hh経路を標的とした治療戦略はがん治療の焦点の一つとなっているが、胃癌治療のターゲットとしてのHh経路はさらなる研究と検証が必要である。

単細胞シーケンシング技術はがん研究において重要な役割を果たしており、腫瘍の多様性、進化パターン、治療耐性、治療反応性を明らかにすることができる。しかし、単細胞シーケンシング技術は空間的な背景情報を保持することができない。空間トランスクリプトミクス（Spatial Transcriptomics, ST）は、この欠点を補う新興技術であり、組織または腫瘍内の細胞の空間分布と相互作用を明らかにする。RNAシーケンシングデータと空間情報を組み合わせることで、ST技術は組織内の細胞タイプ、位置、相互作用に関する詳細な洞察を提供する。本研究では、単細胞シーケンシングと空間トランスクリプトームデータを組み合わせて、胃癌におけるHh経路の潜在的な分子メカニズムを深く探求し、胃癌の腫瘍異質性をより深く理解し、新たな治療戦略を特定することを目的としている。

論文の出典

本論文は、Guoliang Zhang、Guojun Xia、Chunxu Zhang、Shaodong Li、Huangen Wang、Difeng Zhengによって共同執筆され、著者全員が中国浙江省紹興市中心医院の一般外科に所属している。論文は2024年9月9日に『Genes & Immunity』誌にオンライン掲載され、DOIはhttps://doi.org/10.1038/s41435-024-00297-0である。

研究の流れと結果

データの取得

本研究では、バルクトランスクリプトームデータ、単細胞シーケンシングデータ、空間トランスクリプトームデータの3種類の胃癌データを使用した。バルクトランスクリプトームデータセットおよび関連する臨床情報は、The Cancer Genome Atlas（TCGA）データベースから取得され、407名の胃癌患者のデータが含まれている。単細胞シーケンシングデータセットはGene Expression Omnibus（GEO）データベースから取得され、具体的にはGSE163558およびGSE184198のエントリを含み、3つの胃癌サンプルと2つの対照正常サンプルが含まれている。空間トランスクリプトームデータはCROSTデータベース（ID: visdp000078）から取得され、8つの種から1033の空間トランスクリプトームサンプルを統合し、10x Visium、Slide-seqV2、MERFISH、10x Xenium、NanoString COOの5つの技術プラットフォームを使用している。

単細胞シーケンシング解析

単細胞シーケンシングデータの解析では、すべてのサンプルが10x単細胞シーケンシング法を使用してシーケンシングされた。その後、「Seurat」Rパッケージを使用してSeuratオブジェクトを生成し、すべてのサンプルを統合し、データのフィルタリングと補正を行った。品質管理のため、遺伝子数が200未満または6000を超える細胞、およびミトコンドリア遺伝子の割合（pctMT）が15％を超える細胞を除外した。SeuratNormalizeData関数を使用して各細胞の発現プロファイルを正規化し、logNormalize法を使用して正規化を行った。その後、上位2000遺伝子に対して主成分分析（PCA）を実施し、最初の15の主要成分を選択してUMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）を使用して細胞分布を可視化した。手動アノテーションと先行研究のマーカー遺伝子を参照して、細胞を10の細胞群に分類し、T細胞、B細胞、単球、形質細胞、肥満細胞、上皮細胞、マクロファージ、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞を含む。

Hedgehog経路関連遺伝子セットのスコアリング

Hh経路関連遺伝子の胃癌腫瘍微小環境における発現を評価するために、AUCell、UCells、singscore、GSVA、AddModuleScoreの5つのスコアリング手法を使用した。これら5つの手法のスコア結果を統合し、正規化と標準化を行い、最終的な総合スコアを生成した。その結果、Hh経路関連遺伝子は上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、マクロファージで高度に発現しており、特に腫瘍関連線維芽細胞では正常サンプルに比べて発現が顕著に高かった。

線維芽細胞の発生軌跡解析

Hhスコアに基づいて、線維芽細胞群を選択し、Monocleソフトウェアパッケージを使用して線維芽細胞の発生軌跡を構築した。その結果、Cluster 24の線維芽細胞は発生の初期および中期段階にあり、Cluster 21の線維芽細胞は発生の後期段階にあることがわかった。Cluster 21の線維芽細胞は腫瘍サンプル由来であるため、この発見は正常線維芽細胞が腫瘍関連線維芽細胞に変換される可能性を示唆している。さらに、Wnt2、Gli3、CCND1、Hip1遺伝子が線維芽細胞の発生過程で発現が増加することが確認され、これらの遺伝子が正常線維芽細胞から腫瘍関連線維芽細胞への変換において重要な役割を果たす可能性が示された。

細胞間相互作用解析

Hhが胃癌線維芽細胞において果たす役割を深く探るために、線維芽細胞をHh高発現線維芽細胞（Hh_high_fib）とHh低発現線維芽細胞（Hh_low_fib）に分類し、CellChatソフトウェアパッケージを使用して細胞間コミュニケーション解析を行った。その結果、Hh_high_fibは他の細胞群と直接相互作用し、特にシグナル送信者として上皮細胞および内皮細胞と相互作用することがわかった。これらの発見は、Hh関連上皮細胞が胃癌腫瘍において重要な役割を果たすことを示唆している。

空間トランスクリプトーム解析

空間トランスクリプトームデータの解析では、10x空間トランスクリプトーム法を使用してデータを処理し、Seurat Rソフトウェアパッケージを使用して正規化およびバッチ効果の除去を行った。次元削減クラスタリングおよびデコンボリューション解析により、内皮細胞、上皮細胞、Hh_high_fib、Hh_low_fib、マクロファージ、肥満細胞、形質細胞、平滑筋細胞、T細胞の9つの異なる細胞タイプを識別した。相関分析では、Hh高発現線維芽細胞は平滑筋細胞と正の相関があり、Hh低発現線維芽細胞と負の相関があることが示され、Hh発現が線維芽細胞の発生と分化において重要な役割を果たすことが示された。

CCND1線維芽細胞の胃癌における役割

CCND1が線維芽細胞の発生において重要な役割を果たすことに基づいて、線維芽細胞をCCND1陽性線維芽細胞（CCND1+ fib）とCCND1陰性線維芽細胞（CCND1- fib）に分類した。空間トランスクリプトームデータの解析により、CCND1陽性線維芽細胞は主にCluster 1、5、6で高度に浸潤していることがわかった。さらに、Cluster 1の細胞は発生の初期段階にあり、Cluster 5および6の細胞は発生の後期段階にあり、CCND1発現は発生の中後期に増加することが確認され、腫瘍発生の中後期において重要な役割を果たす可能性が示された。

バルクトランスクリプトーム生存解析

バルクトランスクリプトームデータを統合し、CCND1+線維芽細胞の浸潤が胃癌患者の予後に与える影響を評価した。その結果、CCND1レベルは胃癌腫瘍組織で正常組織に比べて有意に高く、CCND1+線維芽細胞の高浸潤患者は予後が悪いことがわかった。さらに、CCND1+線維芽細胞は腫瘍免疫逃避能力と正の相関があり、免疫療法の効果に影響を与える可能性が示された。

結論

本研究では、単細胞シーケンシングと空間トランスクリプトームデータを組み合わせて、胃癌におけるHh経路の役割を深く探求した。バルクトランスクリプトームデータに基づいて、CCND1+線維芽細胞の高浸潤が胃癌患者のリスク因子であり、免疫療法および化学療法の効果に影響を与える可能性があることが確認された。研究は、胃癌およびHh経路の研究に独自の洞察を提供し、がん治療戦略に新たな方向性を示した。

研究のハイライト

1. 重要な発見：Hh経路は胃癌線維芽細胞で高度に発現し、CCND1+線維芽細胞の高浸潤は胃癌患者のリスク因子である。
2. 手法の革新：単細胞シーケンシングと空間トランスクリプトームデータを組み合わせることで、胃癌腫瘍微小環境における細胞異質性と相互作用を包括的に解明した。
3. 応用価値：研究結果は、特にHh経路およびCCND1を標的とした胃癌治療戦略に新たな方向性を提供する。

今後の研究方向

今後の研究では、多施設データおよび多様な患者集団に拡張することで、結果の普遍性と堅牢性を高めることができる。さらに、他のオミクス技術を組み合わせることで、胃癌の進行および治療耐性の分子メカニズムをさらに探求し、より効果的な個別化治療戦略の開発に貢献することができる。