TGF-β信号通路的破坏对于人类iPSC来源的NK细胞有效杀死肝细胞癌是必要的

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TGF-β 信号通路 NK细胞 肝细胞癌 iPSC 抗肿瘤 免疫治疗

背景介绍

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见的原发性肝癌类型，五年生存率不到20%，治疗手段极为有限。传统的靶向药物治疗，如索拉非尼和其他激酶抑制剂，虽已用于HCC的治疗，但疗效有限，难以达到根治。近年来，免疫治疗在HCC治疗中获得了关注，然而，针对实体瘤的免疫疗法（如嵌合抗原受体T细胞和自然杀伤细胞）却面临着肿瘤微环境抑制性因素的挑战。在HCC微环境中，高浓度的转化生长因子-β（Transforming Growth Factor Beta, TGF-β）已被证实可抑制免疫细胞的活性，对抗肿瘤免疫的效果造成阻碍。因此，TGF-β信号的抑制可能成为提高免疫疗法效果的重要路径。

本项研究由University of California, San Diego的Jaya Lakshmi Thangaraj团队完成，发表于2024年9月5日的《Cell Stem Cell》期刊上。研究利用人类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）衍生的自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK cells）进行基因工程改造，使其在HCC高TGF-β环境下仍能发挥高效抗肿瘤作用，为未来NK细胞治疗HCC提供了新的研究视角。

研究流程

实验流程概述

该研究利用iPSCs作为起始细胞源，首先通过CRISPR-Cas9基因编辑技术删除TGF-β受体2（TGFBR2），生成TGFBR2缺失（knockout, KO）和TGFBR2显性负性（dominant negative, DN）形式的NK细胞；接着，将目标抗原的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）引入iPSC-NK细胞以实现特异性杀伤。CAR的设计针对HCC常见的Glypican-3（GPC3）和甲胎蛋白（AFP），从而提高其对HCC的特异性。研究分两个主要策略进行：一是TGF-β信号抑制（TGFBR2-KO和TGFBR2-DN）；二是结合CAR技术提升NK细胞的抗肿瘤效果。

实验流程详解

  1. TGFBR2敲除和显性负性受体表达的构建：通过CRISPR-Cas9编辑，研究团队针对TGFBR2的外显子2设计引导RNA，对iPSCs进行编辑，使之形成TGFBR2-KO单克隆。利用PiggyBac转座子系统将显性负性形式的TGFBR2基因（TGFBR2-DN）导入iPSCs，获得了功能完整的TGFBR2-DN iPSC-NK细胞。

  2. iPSC-NK细胞的分化与扩增：经过六天的分化培养，这些编辑后的iPSCs成功分化为早期造血前体细胞。继续在NK细胞培养条件下培养五周后，细胞表达典型NK细胞标志（CD45和CD56），显示出典型NK细胞的活性和表型，证明了TGFBR2编辑不会影响NK细胞的分化。

  3. 功能验证与抗肿瘤活性测试：研究测试了TGFBR2-KO和TGFBR2-DN iPSC-NK细胞在高浓度TGF-β条件下的抗肿瘤活性。结果表明，编辑后的NK细胞在0至100 ng/ml浓度的TGF-β条件下，依然能够有效杀伤HCC细胞系（HepG2和SNU-449）。反之，未经编辑的NK细胞在高浓度TGF-β下，其抗肿瘤效果显著下降。进一步测试了这些NK细胞的脱颗粒功能（CD107a表达）和细胞因子的分泌能力（IFN-γ和TNF-α表达），证实了TGFBR2-KO和TGFBR2-DN iPSC-NK细胞在TGF-β存在下保持高效的抗肿瘤能力。

  4. CAR表达的抗肿瘤活性：将抗GPC3和AFP的CAR引入TGFBR2-KO和野生型（WT）iPSC-NK细胞，验证了CAR特异性NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。虽然CAR的表达提升了NK细胞的特异性杀伤能力，但TGF-β环境对WT iPSC-NK细胞的抑制作用明显，无法在高浓度TGF-β下达到有效抗肿瘤效果。相反，TGFBR2-KO CAR-NK细胞在TGF-β环境中依旧保持较高的抗肿瘤活性，证明TGF-β信号的抑制是实现CAR-NK细胞抗肿瘤活性的关键。

  5. 基因表达和转录组分析：通过RNA测序分析对比WT、TGFBR2-KO和TGFBR2-DN iPSC-NK细胞，发现TGFBR2编辑后NK细胞在多种抗肿瘤相关基因（如CD226、IFNG、GZMB、CXCR4等）上有显著表达变化。分析结果显示，在TGFBR2-KO和TGFBR2-DN NK细胞中，NK细胞活化、肿瘤浸润、化学因子受体等相关基因表达显著提高，形成增强的抗肿瘤功能基础。

  6. 体内实验验证：在异种移植小鼠模型中，对HepG2移植肿瘤进行不同处理。结果表明，TGFBR2-KO iPSC-NK细胞在体内抑制肿瘤生长的效果显著优于WT iPSC-NK细胞组，且其抗肿瘤效果不受CAR表达影响。此外，TGFBR2-KO iPSC-NK细胞在小鼠体内表现出更好的持久性和存活率，进一步证明TGF-β信号抑制对NK细胞疗法的重要性。

研究结果

  1. TGFBR2敲除或显性负性受体在iPSC-NK细胞中的应用有效防止了TGF-β抑制：TGFBR2-KO和TGFBR2-DN iPSC-NK细胞在TGF-β存在下依旧能够保持高效的抗肿瘤活性，表明TGF-β信号的抑制对于NK细胞在肿瘤微环境中的生存和抗肿瘤活性至关重要。

  2. 结合CAR表达对HCC的特异性靶向作用：尽管CAR-NK细胞能够识别HCC细胞的特异性抗原GPC3和AFP，但在TGF-β环境中，其抗肿瘤效果仍受限。TGFBR2-KO iPSC-NK细胞在此条件下依旧能够保持高效抗肿瘤活性，证实了TGF-β信号抑制的重要性。

  3. 基因表达谱的显著变化支持抗肿瘤活性的增强：RNA测序显示，TGFBR2-KO和TGFBR2-DN iPSC-NK细胞中抗肿瘤和NK细胞活化相关基因显著上调，这为其增强的抗肿瘤功能提供了分子依据。

  4. 体内异种移植小鼠实验进一步验证了抗肿瘤效果和持久性：在异种移植HepG2肿瘤的小鼠模型中，TGFBR2-KO iPSC-NK细胞显著延缓了肿瘤生长，提高了NK细胞在体内的存活率，表明TGFBR2-KO和DN设计对NK细胞在实体瘤中的应用潜力巨大。

研究价值与意义

本研究为NK细胞在高TGF-β肿瘤微环境中的应用提供了新的视角。尽管CAR技术提高了NK细胞对特定肿瘤的靶向能力，但在HCC微环境中，TGF-β的存在仍是有效抗肿瘤的主要障碍。通过基因编辑抑制TGF-β信号，本研究成功增强了NK细胞在TGF-β丰富环境下的生存和抗肿瘤效果，为未来的NK细胞疗法开辟了新途径。

同时，iPSCs作为NK细胞来源的标准化优势为该疗法的规模化和多重基因编辑提供了支持，使其具有“现成型”细胞治疗的潜力。此项研究为NK细胞在HCC和其他高TGF-β肿瘤中的应用奠定了基础，为未来免疫疗法的进一步发展提供了重要的实验依据。

研究亮点与创新点

  • 高效TGF-β抑制：利用TGFBR2基因敲除或显性负性受体，确保NK细胞在TGF-β抑制环境下的抗肿瘤活性。
  • iPSC-NK细胞平台的标准化：基于iPSCs的NK细胞生成实现了多重基因编辑的便捷性与批量化生产的可行性。
  • 异种移植模型验证有效性：在小鼠体内实验中，验证了TGFBR2-KO和CAR表达对HCC的抑制效果。

本研究展示了TGF-β信号抑制对NK细胞疗法在实体瘤中的潜在提升作用，并为未来临床试验提供了新的基因编辑策略与细胞治疗方案。